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高效毛细管电色谱仪分析技术

2016-05-09  中国传感器在线  已被阅读:432次

高效毛细管电色谱仪(CEC)整合了高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的优点,在毛细管柱中填充固定相颗粒、管壁键合或涂覆固定相、制成连续床固定相,以压力和电渗流共同驱动流动相,利用样品各组分在固定相和流动相中分配系数差异和本身淌度差异进行分离。在HPLC和CE双重分离机理的作用下,CEC对样品细微之处的分辨能力得到极大提高,既能分离带电组分,又能分析中性分子,对复杂的混合样品显示出强大的分离潜力,代表高效微分离分析的趋势。
    一、发展历史:
    1974年,CEC首次出现,将电场施加到填充毛细管柱上,分离了数种溶质,显示出以电渗流作为驱动力的优越性。但当时并没有引起足够的关注。
    1981年,将10μm ODS填料填入170μm内径的毛细管柱中,在电场作用下成功分离了数种多环芳烃,获得了31000TP/m的柱效,第一次展示了CEC的巨大潜力。
    二、工作原理:
    CEC采用HPLC固定相,通过高压输液泵产生的液压和在毛细管柱两端加上高压直流电场所产生的电场力,即依靠液压和电渗流共同驱动流动相,使样品组分根据它们的色谱行为和电泳速度的不同而达到分离。CEC具有HPLC和CE双重分离机理,如同HPLC基于组分在固定相和流动相中的分配过程,如同CE基于组分的电迁移过程,使分离选择性得到极大提高。电渗流的塞形流型改善了组分在毛细管柱中的流型和峰展宽,可获得远高于HPLC的柱效,对复杂样品的分离能力远远超过单独使用HPLC和CE。
    三、输液系统:
    1、驱动流动相的动力:
    以高压输液泵和电渗流泵共同驱动流动相,流动相在液压和电渗流的共同作用下通过毛细管柱,可稳定输送几百纳升的流量。液压和电压可同时或独立地施加在毛细管柱两端,具有以下明显的优势:
    (1)可有效抑制分离体系中气泡的产生。
    (2)采用压力流和阀进样,可方便地实现二元溶剂梯度洗脱,提高分析的灵活性、选择性和分离速度。
    (3)从进样到分离的整个过程中,高压直流电场不间断,保证了系统的稳定性和分析的重现性。
    2、微流控制系统:
    微流控制系统由分流阀、反压阀、溶剂混合阀、定量进样阀和限流阀等组成。
    (1)分流阀和反压阀:
    维持恒定的毛细管柱前压是色谱体系稳定的关键,可通过分流阀和反压阀来实现。溶剂由高压输液泵以恒流形式泵出,在分流阀处转为恒压形式驱动,从而与高压直流电场的电渗流相匹配,实现由样品压力和电场对柱内溶剂的同时驱动。
    (2)溶剂混合阀:
    50μL溶剂混合阀可实现二元溶剂的梯度混合,在保证混合效率的同时,抑制了梯度延时,保证了分析的准确性和重现性。
    (3)定量进样阀:
    定量进样阀为纳升级定容进样,保证了进样的准确性和重复性。压力流和进样阀的存在,使系统可与样品处理相连,实现实时在线样品分析。
    该阀采用内置定量环,通过刻蚀实现纳升级定量环的加工。定量环的出口通道为100μm,可通过PEEK接头与100μm内径的毛细管柱相连,极大地抑制了死体积的影响。
    (4)限流阀:
    限流阀的作用是在毛细管柱的出口端保持一定压力,可抑制由于压力骤然变化引起的气泡,保证系统的稳定性。
    (5)微流控制系统的连接管路:
    微流控制系统的连接管路的内径与定量进样阀接口处的孔径相同,从最大程度上减小了进样死体积和柱外体积的影响。
    四、高压直流电源:
    1、0~30kV稳定、连续可调的直流电源。
    2、具有恒压、恒流和恒功率输出。
    3、具有电场强度程序控制功能。
    4、电压稳定性在±0.1%。
    5、电源极性易转换。
    五、固定相:
    固定相是影响电色谱柱柱效、分离选择性和分离速度的重要因素,是发展新型CEC分离模式的基础。
    固定相的选择主要依据HPLC的理论和经验。HPLC的各种固定相已被应用于CEC中,其中十八烷基硅烷键合硅胶固定相(ODS)应用最多。CEC结合了HPLC和CE的动力优势,不单纯依靠压力驱动毛细管柱中流动相的流动,还通过在毛细管柱两端加上高压直流电场所产生的电场力驱动,大大降低了柱内压力。因此,CEC进行分析时,可使用内径细小的毛细管柱和粒径超小的填料(1.5~3μm),而不用担心高反压,大大提高了柱效和分离效果。实验表明,只要固定相颗粒粒径≥0.5μm,电渗流速度与固定相颗粒大小和填充均匀程度无关。
    分离手性化合物时,可在固定相上键合手性选择剂,也可用非手性固体相在缓冲液中加入手性选择剂进行拆分。
    混合官能团固定相是专门针对CEC研制的新型固定相,是在硅胶表面同时键合具有反相色谱性能的烷基官能团和具有离子交换性质的磺酸官能团,在很宽的pH范围内都能保持良好的电渗流。
    六、流动相:
    根据固定相的正相和反相等特性,流动相可以是水溶液或有机溶液。常用流动相有乙腈-水、甲醇-水等。
    七、电色谱柱:
    电色谱柱是CEC的核心部件,按固定相形式不同可分为填充毛细管柱、开管毛细管柱和整体毛细管柱。
    1、填充毛细管柱:
    填充毛细管柱是将固定相填充到毛细管中,通过两端烧结柱塞将固定相保持在毛细管中而成。其最大优点是可利用众多的HPLC固定相,根据化合物与固定相的作用不同实现高效分离,在CEC中应用最广泛。
    (1)制备方法:
    1)柱塞:
    柱塞制备对填充毛细管柱非常关键。
    ①柱塞必须满足的要求:
    有足够的机械强度,能承受填充时的高压。
    化学惰性,耐有机溶剂和宽pH值的缓冲液。
    有合适的孔隙度,既不使流动相受阻,又可防止固定相颗粒通过。
    死体积小,避免峰展宽。
    ②柱塞制备方法:
    柱塞制作方法很多,目前应用较多的是水玻璃烧制法和填料直接烧制法。
    2)填充毛细管柱:
    填充毛细管柱的填充方法有高压匀浆填充法、电动填充法和超临界CO2法等。
    ①高压匀浆填充法:
    高压匀浆填充法是填充毛细管柱最常用的制备方法。
    填充过程一般包括烧结进样端柱塞、高压填充、烧结出口端柱塞、除去不需要的固定相和检测窗口制作等步骤。
    高压匀浆填充法简单,快速,但操作技术要求较高。由于在分离样品时施加电场,会使表面带电荷的固定相沿某一方向电泳,容易造成柱局部过于紧密产生较大的压力,而局部由于固定相迁移形成较大的空隙。
    ②电动填充法:
    电动填充是利用电泳原理,使固定相在一定pH下带电荷,在电场中定向移动而把固定相填充到毛细管中。与高压匀浆填充法相比,电动填充法可有选择地把荷质比相同的固定相填入毛细管中,柱床均匀。
    ③超临界CO2法:
    超临界CO2法是在毛细管柱一端制作临时柱塞后,另一端与贮液罐相连,将预填充的填料放入贮液罐中,然后利用超临界CO2将填料填入毛细管中,再缓慢释放压力至常压而得到干的色谱柱。柱使用前用流动相润洗,平衡。
    (2)特点:
    1)优点:
    ①柱效高。
    ②固定相资源丰富。
    2)缺点:
    ①存在柱塞制备和柱填充,步骤繁琐。
    ②重现性差。
    (3)气泡问题:
    填充毛细管柱CEC操作的困难是分离过程中常伴有气泡产生。气泡一般产生在柱塞与固定相交界处和柱塞与检测窗口交界处。为了控制气泡产生,目前主要采取以下措施:
    1)在柱两端同时施加低压,可较好的解决气泡问题。
    2)制备渗透性好的柱塞。
    3)在分流阀处接一阻尼管,当电极处有气泡产生时,气泡会经分流阀通过阻尼管排出。
    4)利用超声波使流动相和样品充分脱气。
    2、开管毛细管柱:
    开管毛细管柱是将固定相键合或涂敷在毛细管壁上,引入色谱分配机理。
    (1)制备方法:
    开管毛细管柱制备的关键是增大
比表面积,以制备相比大和柱容量大的色谱柱。
    1)键合固定相。
    2)涂覆聚合物固定相。
    3)溶胶-凝胶法。
    4)分子印记法。
    (2)特点:
    1)优点:
    ①与填充毛细管柱相比,由于没有涡流扩散,分离效率更高,分离时间大大缩短。
    ②由于不用柱塞,制备简单,减小了气泡产生的可能性。
    2)缺点:
    开管毛细管柱的相比是填充毛细管柱的1/350,柱容量小,对溶质的保留有限。
    为了增加相比和柱容量,开管毛细管柱一般使用比较细的毛细管(<25μm),通过各种方法对管壁进行处理。
    3、整体毛细管柱:
    整体毛细管柱是采用有机和无机方法在毛细管中进行原位自由基聚合反应或固化,形成连续床固定相。目前是电色谱柱研究的热点。
    整体毛细管柱一般采用柱内直接键合的方法形成整块多孔的交联聚合物,不用柱塞,简化了柱制备过程。通过改变单体可引入多种官能团,有更好的多孔性和渗透性,对流动相阻力小,溶质在固定相和流动相之间快速分配,有利于实现高速分离。可对生物大分子进行快速分离。
    按基质不同可分为无机基质整体毛细管柱、有机基质整体毛细管柱、颗粒固定化整体毛细管柱和杂化材料整体毛细管柱。
    (1)无机基质整体毛细管柱:
    无机基质整体毛细管柱是通过溶胶-凝胶反应使硅烷化试剂形成牢固的Si-O-Si网络骨架。溶胶-凝胶反应一般包括至少一种前导物质(通常是烷氧基硅烷)、溶剂、催化剂、有机添加剂和水,将这些物质的溶液引入经预处理的毛细管后,在柱中水解缩聚生成凝胶,然后进行老化、干燥,制成硅胶基质整体毛细管柱。
    在溶胶-凝胶反应过程中,催化剂HCl和单体含量对整体柱的结构有影响。增加HCl浓度可增加柱强度,增加分离效率。当HCl浓度低时,没有足够的硅醇基水解形成网络骨架。增加单体和致孔剂的比率会减小孔径,增加骨架密度,降低渗透性。当单体浓度小于5%时,单体只能与管壁结合,不能形成整体柱。当单体浓度大于18%时,柱渗透性非常差。
    溶胶-凝胶技术具有纯度高、均匀性好和合成温度低等特点,近年在材料科学领域得到了广泛应用。
    硅胶基质整体毛细管柱机械强度良好,耐有机溶剂,硅胶骨架和通孔尺寸可独立控制,但使用过程会出现收缩、开裂和干结等问题,很多情况下柱制备和修饰不能同时进行。
    另外,还有以氧化锆和二氧化钛为基质的整体柱,但这方面的研究远不及硅胶基质整体毛细管柱广泛和深入。
    (2)有机基质整体毛细管柱:
    有机基质整体毛细管柱有以聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯为基质的整体柱。典型的聚合液以含一个乙烯基的化合物为单体,以含两个乙烯基的化合物为交联剂,以含离子基团的化合物为产生电渗流的单体,为了形成多孔结构往往添加致孔剂。
    有机基质整体毛细管柱种类比较单一,机械强度较差,容易发生收缩和溶涨现象,使柱性能发生变化,影响柱寿命。
    1)聚丙烯酰胺基质整体毛细管柱:
    以聚丙烯酰胺为基质的整体柱从1995年首次出现以来得到了广泛应用。最初的整体柱一般以丙烯酰胺为单体,以亚甲基二丙烯酰胺为交联剂,以含离子基团的化合物为产生电渗流的单体,所得到的整体柱是亲水性较强的柱床。为了获得疏水性较强的柱床,可添加疏水性较强的单体,如十四烯、十六烯和十八烯等,利用反相机制进行分离。
    2)聚甲基丙烯酸酯基质整体毛细管柱:
    以聚甲基丙烯酸酯为基质的整体柱是硬质柱床,柱制备比较简单,毛细管壁可不经过预处理将聚合物混合液引入到柱中后,经水热处理可得到柱体与管壁结合很好的整体柱。
    以2-(三甲基磺酸甲酯铵)乙基甲基丙烯酸酯(MEAMS)为单体,以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,以正丙醇和1,4-丁二醇的混合液为致孔剂,可得到具有反相和离子交换混合模式的整体柱。MEAMS中的铵基既作为产生反向电渗流的基团,又作为强离子交换固定相。该整体柱对中性化合物表现出反相色谱机制,对带电荷的物质既有反相作用机制,又有离子交换作用机制。使用该整体柱分离碱性化合物时,还消除了一般电泳和电色谱中由于碱性化合物吸附所造成的峰拖尾现象。
    3)聚苯乙烯基质整体毛细管柱:
    以聚苯乙烯为基质的整体柱是硬质整体柱。目前单体种类比较少,一般是苯乙烯-二乙烯苯共聚物。
    (3)颗粒固定化整体毛细管柱:
    颗粒固定化整体毛细管柱是将填料的溶胶-凝胶悬浮液引入毛细管中进行原位聚合,或将填料颗粒填充到毛细管中后,再采用如高温烧结、溶胶-凝胶等方式,形成连续床层的整体柱。由于颗粒的存在,减少了柱制备过程中的收缩和干裂。
    (4)杂化材料整体毛细管柱:
    采用有机-无机杂化的方法,使整体柱的形成和衍生同时完成。柱制备简单,可通过调节不同前导物质的比例来调整疏水相在整体柱中的比例。
    八、检测器:
    CEC的检测器有紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器和拉曼光谱检测器等。
    九、特点:
    1、超高效分离:
    分离效率比HPLC高,25万以上TP/m。
    2、超快速分离:
    30s内可完成4种样品的分离。
    3、超高峰容量:
    3倍于HPLC的峰容量。
    4、超高分离精度:
    重现性与HPLC相媲美。
    5、超高选择性:
    选择性比CE高。
    6、梯度洗脱:
    微流控制系统显着降低了体系的死体积,可实现高压梯度洗脱,可分离分子结构相近或电泳淌度接近的混合物。
    7、定量进样:
    纳升级阀进样,大幅度提高了进样的准确性和重复性。
    8、微流化,环境友好:
    CEC的毛细管柱中流量为0.2~1μL/min,消耗溶剂和样品量是HPLC的万分之一。HPLC的进样量为微升级,无法分析纳升级样品。CEC的进样量只为纳升级,过多的取样量往往会致死本体,在活体取样时体现出巨大优势。
    与HPLC相比,CEC的分析时间更短、柱内径更细、分离速度更快,使溶剂消耗量更少,由此产生的废液更少,大大降低了成本,保护环境。
    十、应用:
    CEC为蛋白质组学、生物医药学、天然药物分析、环境保护、食品安全和手性化合物分析等领域提供了创新的技术手段。填充毛细管电色谱在蛋白质分析中有重要潜力。

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